Kurkistus labran ovien taakse, osa 1

23.9.2015 | Toni Sandvik

Työni alkoi siitä, että monistin haluamaani proteiinia koodaavan geenin polymeraasiketjureaktion eli PCR:n avulla. PCR:ssä DNA-pätkä denaturoidaan eli sen kaksi juostetta erotetaan toisistaan ja molemmille rakennetaan uudet vastinjuosteet irrallaan olevista nukleotideista. Näitä vaiheita toistamalla juosteiden määrä kasvaa eksponentiaalisesti. Geenin siirto onnistuu todennäköisemmin, kun bakteerien kanssa samaan liuokseen siirretään miljardi kopiota siitä ja yritetään saada ainakin yksi niistä bakteerin sisälle.

Tämän jälkeen vuorossa oli elektroforeesi, jossa aineet erotellaan kokonsa mukaan kuljettamalla niitä sähkökentässä huokoisen agaroosigeelin läpi. Oikean kokoiset juosteet oli sitten helppo leikata ja eristää geelistä, katkaista entsyymeillä (digestio), puhdistaa ja kiinnittää geenin kuljettajiin eli vektoreihin (ligaatio). Sitten vektoreihin liitetyt juosteet (insertit) voitiin siirtää bakteeriin (transformaatio). Kuten suluissa olevista sanoista voi lukea, alan termit on pitkälti lainattu suoraan englannista eivätkä ehkä sellaisenaan ole kovin kuvaavia suomeksi, mutta niitä ei kannata pelätä: useimmiten hienotkin termit kuvaavat melko yksinkertaisia asioita.

Kun vektorit olivat siirtoa varten valmiita, bakteerit kuumennettiin vajaan minuutin ajaksi 42 asteeseen, jotta jokin vektoreista saisi solukalvon pinnalle sattuessaan tilaisuuden sujahtaa solukalvon läpi bakteerin sisälle. Lämpöshokista toivuttuaan bakteerit laitettiin kasvamaan maljoille. Mutta miten on mahdollista tietää, millä niistä miljardista maljoille istutetusta bakteerista on vektori sisällään?

Ei tietenkään mitenkään, mutta tähän on kätevä ratkaisu: vektori pitää sisällään myös vastustuskyvyn jotain antibioottia vastaan. Itse käytin kahta eri vektoria, joista toisessa oli vastustuskyky ampisilliinia ja toisessa kanamysiiniä vastaan. Kun bakteerit laitettiin maljalle, jossa oli vastaavaa antibioottia, tavalliset bakteerit kuolivat transformaatiobakteerien kasvaessa iloisesti.

Bakteerien jakauduttua niistä eristettiin DNA:t sekvensointia varten, jotta saatiin selville juosteiden tarkka nukleotidijärjestys. Kauhukseni yhdessä näytteistä oli pieni mutta kohtalokas mutaatio – sen koodaamassa proteiinissa olisi ollut yksi ominaisuuksiltaan hyvin erilainen aminohappo, minkä takia valkuaisaine olisi laskostunut väärin. Työtä olisi siis ollut turha jatkaa sillä näytteellä. En kuitenkaan joutunut aloittamaan alusta, sillä näytteestä oli onneksi olemassa rinnakkaisnäyte, jonka sekvenssi oli täsmälleen oikea.

Tähän asti kaikki meni oikein mallikkaasti, mutta puhdistusvaiheessa proteiinini osoittautuikin suunniteltua vaikeammaksi eristää, sillä sitä ei saanut käyttämällämme protokollalla liukenemaan. Kaiken lisäksi se ei pysynyt yhtenä kappaleena vaan pilkkoutui, mikä teki sen kokonaisena eristämisestä tietenkin mahdotonta. Asiaa pähkäiltiin porukalla, mutta mitään ilmeistä ratkaisua ei tuntunut löytyvän.

Lopulta suunnitelmat jouduttiin laittamaan uusiksi, koska projektini ei ollut tarkoitus olla liian haastava – todettiin, että on mielekkäämpää saada tästä harjoittelusta konkreettisia tuloksia sen sijaan, että yrityksen ja erehdyksen kautta kokeiltaisiin erilaisia menetelmiä ja toivottaisiin työn onnistuvan. Lopputuloksena ryhmänjohtajani otti POC1:n murheekseen ja minä sain uuden vastaavan projektin: puhdistaa Sso1- ja Sec3-nimiset proteiinit ja kiteyttää niiden yhdessä muodostama kompleksi. Miten uusi projektini sitten meni? Siitä lisää ensi numerossa!

-Toni