Kurkistus labran ovien taakse, osa 2

2.12.2015 | Toni Sandvik

Kovin pitkään en asiaa ehtinyt sulatella, sillä perjantaina töistä lähtiessäni sain kuulla aloittavani alusta toisen työn parissa maanantaina.

Hämmennyksestä huolimatta uusi projekti lähti kuitenkin mukavasti käyntiin, sillä kokemusta oli kertynyt tässä vaiheessa jo kuukauden verran ja työ tehtiin samalla periaatteella kuin aiempikin. Oikeastaan oli hyödyllistä päästä tekemään kaikki vaiheet toiseen kertaan, kun toiston kautta sai lisää rutiinia ja kokemusta. Erilaisia työvaiheita oli myös ylipäätään sen verran paljon, ettei yksitoikkoisuudesta voinut valittaa.

Uuden projektini tavoitteena oli tuottaa ja eristää kahta proteiinia nimeltä Sso1 ja Sec3, yhdistää ne ja kiteyttää niiden muodostama kompleksi rakennetutkimuksia varten. Onnistuin kasvattamaan niin Sso1- kuin Sec3-proteiiniakin tuottavia bakteereja samalla tavalla kuin aiemminkin (tarkemmat työvaiheet kerroinkin jo aiemmassa kirjoituksessani), jotka muussasin korkean paineen avulla niin kutsutussa homogenisaattorissa.

Kun bakteerit oli hajotettu, alkoi varsinainen puhdistusvaihe. Tämä tarkoitti vuorotellen näytteen puhdistamista ajamalla näytettä ÄKTA-puhdistusjärjestelmässä ja puhtauden tarkkailua geelielektroforeesin avulla. ÄKTA oli hieno ja kallis pumppusysteemi, jolla saattoi erotella näytteen sisältämiä aineita kromatografiaan perustuen ajamalla niitä erilaisten pylväiden läpi. Pylväästä riippuen erottelu tapahtui esimerkiksi sähköstaattisten vuorovaikutusten tai molekyylien koon mukaan.

Elektroforeesilla eri aineet saatiin eroteltua kokonsa mukaan geelillä, jolta voitiin tarkkailla näytteen puhtautta. Proteiinien kanssa käytetty elektroforeesi on niin kutsuttu SDS-PAGE, jonka koko nimi ansaitsee erityismaininnan suosikkiyhdyssananani: natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi. Jostain syystä koko nimeä harvoin kuulee käytettävän.

Monivaiheisen puhdistamisen jälkeen valkuaisaineet olivat lopulta riittävän puhtaita kiteyttämistä varten. Itse kiteyttäminen tehdään siksi, että proteiinit saadaan pakattua ikään kuin toistuvaksi kuvioksi, josta voidaan selvittää ja laskea niiden rakenne ampumalla niitä röntgensäteillä ja tutkimalla, miten säteet muuttuvat kiteen läpi mennessään. Rakenteen laskeminen tällaisesta diffraktiokuviosta onkin sitten monimutkaisempi homma enkä sitä sentään harjoittelussani päässyt tekemään.

Proteiinien kiteytymään laittaminen oli helppoa, sillä siinä apunani oli Phoenix-robotti, joka käytännössä hoiti hommat puolestani. Kiteytymisestä tekee kuitenkin hankalan se, että eri proteiinien fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet vaihtelevat suuresti, minkä takia on vaikea ennustaa kiteytymiselle sopivia olosuhteita. Tämän takia se voi olla melkoista hakuammuntaa: itse käytin työssäni joka näytteelle kuutta levyä, joilla oli jokaisella 96 erilaista olosuhdetta, yhteensä siis melkein 600 eri olosuhdetta! Vaihdeltavia tekijöitä ovat esimerkiksi puskuriliuoksen sisältämä suolan määrä ja pH sekä lämpötila. Kun levyt oli valmisteltu, joka olosuhde tarkistettiin mikroskoopilla päivittäin kiteiden toivossa.

Harjoitteluaikana ei kiteitä vielä muodostunut, mihin olin varautunutkin sen haasteellisuuden takia. Olin kuitenkin onnistunut tuottamaan puhdistettua proteiinia tuleviakin kiteytyskokeita varten, joten turhaan en ollut paria kuukautta työskennellyt. Myöhemmin kuitenkin tiedustelin asiasta ja sain kuulla, että tiettyihin olosuhteisiin oli kuin olikin ajan kanssa muodostunut pieniä kiteitä! Niitä oli tutkittu röntgensäteillä ja työtäni oli jatkettu optimoimalla olosuhteita vielä paremmaksi. Loppujen lopuksi työ onnistui siis paremmin kuin osasin odottaakaan.

-Toni